活體單細(xì)胞顯微技術(shù)成像可實(shí)時(shí)表征基于單細(xì)胞水平的生理變化，有助于揭示組織間的信號(hào)傳輸機(jī)制和細(xì)胞相互作用，對(duì)于預(yù)測(cè)和調(diào)控疾病進(jìn)展至關(guān)重要的。然而，基于傳統(tǒng)的可見和近紅外光（NIR-I，<900 nm）顯微成像面臨嚴(yán)重的光衰減問(wèn)題，活體顯微通常需要在成像部位進(jìn)行手術(shù)以暴露目的組織。然而這種手術(shù)開窗輔助成像不可避免地會(huì)改變局部血管通透性，誘發(fā)皮膚、肌肉或顱骨等組織炎癥，誘發(fā)成像區(qū)域組織的微環(huán)境變化。

為此，復(fù)旦大學(xué)張凡教授研究團(tuán)隊(duì)率先開發(fā)了基于近紅外第二窗口熒光（NIR-II，~1500 nm）的活體無(wú)創(chuàng)顯微技術(shù)。張凡教授最新發(fā)表的Nature Protocols論文詳細(xì)介紹了如何利用NIR-II納米熒光探針進(jìn)行活體顯微成像，以避免在活體組織中的衰減，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)深腦組織中的單細(xì)胞動(dòng)態(tài)追蹤，采用光學(xué)性能優(yōu)異的稀土納米探針ErNPs和TmNPs標(biāo)記活體中的中性粒細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了對(duì)腦卒中小鼠腦皮層中中性粒細(xì)胞無(wú)創(chuàng)動(dòng)態(tài)可視化和遷移行為分析。在這篇文章中，研究團(tuán)隊(duì)詳細(xì)介紹了NIR-II顯微成像用于活體動(dòng)態(tài)細(xì)胞追蹤的實(shí)驗(yàn)方案（圖1），從NIR-II納米熒光探針的設(shè)計(jì)合成與表征，多通道NIR-II顯微成像設(shè)備的靈活搭建，活體標(biāo)記細(xì)胞，NIR-II活體顯微成像實(shí)驗(yàn)的前期準(zhǔn)備與實(shí)時(shí)成像操作，數(shù)據(jù)分析等多方面進(jìn)行了詳細(xì)的介紹。

圖1. 近紅外二區(qū)活體熒光顯微成像技術(shù)的工作示意圖

其中，團(tuán)隊(duì)利用開發(fā)的新型近紅外二區(qū)稀土熒光探針特異性的標(biāo)記了小鼠的中性粒細(xì)胞以研究炎癥血管中活化中性粒細(xì)胞的體內(nèi)成像（圖2）。中性粒細(xì)胞能夠在血管內(nèi)壁爬行到外滲部位，然后外滲是中性粒細(xì)胞活化的典型特征。CD11b是一種介導(dǎo)細(xì)胞粘附和遷移的中性粒細(xì)胞表面蛋白，在活化的中性粒細(xì)胞表面表達(dá)上調(diào)。中性粒細(xì)胞上Ly6G和CD11b蛋白的雙重標(biāo)記有助于在體內(nèi)特異性地跟蹤活化的中性粒細(xì)胞。因此，在缺血性腦卒中小鼠模型中，靜脈注射抗ly6g抗體偶聯(lián)的α-TmNPs和抗cd11b抗體偶聯(lián)的α-ErNPs (α-Er-aCD11b)，標(biāo)記活化的中性粒細(xì)胞，雙標(biāo)記的中性粒細(xì)胞表現(xiàn)出微弱的運(yùn)動(dòng)、滾動(dòng)和爬行，表明它們?cè)趦?nèi)皮細(xì)胞表面粘附牢固。此外，可以觀察到雙標(biāo)記的中性粒細(xì)胞，沿著血流的剪切力被拉長(zhǎng)，這通常被認(rèn)為是中性粒細(xì)胞通過(guò)炎癥血管外滲的最后一步。

圖2. 炎癥血管中活化中性粒細(xì)胞的體內(nèi)成像。

最后，本文對(duì)基于NIR-II熒光活體顯微設(shè)備和技術(shù)的適用范圍和應(yīng)用前景進(jìn)行了總結(jié)與展望，致力于將NIR-II熒光顯微技術(shù)推廣于腦科學(xué)、感染科學(xué)、免疫與炎癥、腫瘤、干細(xì)胞等生物醫(yī)學(xué)科學(xué)的基礎(chǔ)研究應(yīng)用中。

參考文獻(xiàn)

Ying Chen, Yiwei Yang, and Fan Zhang*. Noninvasive In Vivo Microscopy of Single Neutrophils In The Mouse Brain Via NIR-II Fluorescent Nanomaterials. Nature Protocols, 2024. DOI: doi.org/10.1038/s41596-024-00983-3.